什么樣的進階武器，會有那么大威力？

CUT&Tag——ChIP-Seq進階武器
 
一、染色質(zhì)免疫沉淀后測序（ChIP-Seq）
ChIP-Seq是一種針對DNA結(jié)合蛋白、組蛋白修飾或者核小體的全基因組測序分析技術(shù)。其基本原理是利用甲醛處理細胞，使目標(biāo)蛋白與DNA交聯(lián)，通過超聲破碎將交聯(lián)后的染色質(zhì)打碎成小片段，一般在200-600bp。再利用抗原-抗體特異性識別反應(yīng)，將目的蛋白連同交聯(lián)的DNA片段一起沉淀下來。洗脫蛋白質(zhì)沉淀，對純化后的DNA進行PCR擴增，高通量測序，最后與已有的基因組序列進行比對，以確定與目的蛋白交聯(lián)的DNA的序列。
ChIP-Seq可以完整的反映與靶蛋白結(jié)合的DNA序列，是蛋白質(zhì)與DNA互作的經(jīng)典方法。但是常規(guī)的ChIP-Seq需要大量的細胞樣本，而且對培養(yǎng)環(huán)境、處理條件要求較高，且實驗重復(fù)性較差、信噪比低。很多時候會發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)了很長周期的細胞，經(jīng)過ChIP-Seq測序后得到的卻是大量的垃圾數(shù)據(jù)，這些限制了ChIP-Seq的應(yīng)用，亟需進化升級。
二、CUT&Tag（Cleavage Under Targets and Tagment）技術(shù)
2019年4月底，弗雷德哈欽森癌癥研究中心的Henikoff博士，在Nature Communication雜質(zhì)上公開了CUT&Tag技術(shù)的詳細結(jié)果和實驗方案。能在全基因?qū)用嫔蠙z測與組蛋白、轉(zhuǎn)錄因子等相互作用的DNA片段。這種方法相較于ChIP-Seq、pA-MNase等方法，更加簡便，信噪比更高、重復(fù)性更好、需要的細胞數(shù)量更少，切有希望將蛋白質(zhì)-DNA結(jié)合研究做到單細胞水平。
CUT&Tag方法是Active motif專利技術(shù)TAM-ChIP技術(shù)的一個變形。CUT&Tag是基于ChIP原理的一項技術(shù)，與ChIP的免疫沉淀步驟相比，同樣是利用抗原抗體結(jié)合，但是CUT&Tag是抗體孵育后直接剪切染色質(zhì)和制備文庫。
在CUT&Tag實驗中，細胞首先要經(jīng)過透化處理，并將其與刀豆蛋白A一起孵育，以便于后續(xù)清洗步驟。細胞隨后先后與特異性抗體（一抗、二抗）孵育；然后將細胞與轉(zhuǎn)座體孵育，轉(zhuǎn)座體由帶有NGS接頭（adaptor）的Tn5轉(zhuǎn)座酶和蛋白A（protein A）融合而成。清洗掉未結(jié)合的轉(zhuǎn)座體。Tn5轉(zhuǎn)座酶是Mg²⁺依賴的酶，因此需要加入Mg²⁺以激活反應(yīng)，從而使染色質(zhì)被切割到接近蛋白結(jié)合位點的位置，同時鏈接上NGS測序接頭DNA序列。這使得染色質(zhì)裂解和文庫制備只需一步完成。
 
 
 
三、
CUT&Tag具體實驗方案
1. 細胞預(yù)處理（0.5-1h）
1) 室溫下收集新鮮細胞置于EP管中并計數(shù)；低速離心，去溶液；
2) 管中加入細胞穿孔緩沖液重懸細胞；低速離心，去溶液；
3）管中加入細胞穿孔緩沖液再重懸細胞，輕柔震蕩并滴加Binding 緩沖液重懸的ConA磁珠，輕柔顛倒混勻5-10min；
2. 一抗結(jié)合目的蛋白（2h）
1) 快速離心EP管，將管蓋液體離心下來，將EP管靜置于磁力架上沉淀細胞，去溶液。
2) EP管中加入預(yù)冷的抗體緩沖液將細胞重懸，輕柔震蕩后置于冰上;
3) 每管中加入0.5-1μl一抗（抗體使用生產(chǎn)商推薦濃度），輕柔震蕩；
4) 室溫下將EP管置于搖床上孵育2h；
3. 二抗結(jié)合一抗（1h）
1) 快速離心EP管，將管蓋液體離心下來，將EP管靜置于磁力架沉淀細胞，去溶液。
2) 將二抗1:100稀釋于穿孔緩沖液，加入管中，輕柔震蕩；
3) 室溫下將EP管置于搖床上孵育30-60min；
4) 快速離心細胞，將管蓋液體離心下來，EP管靜置于磁力架沉淀細胞，去溶液。
5) 管中加入0.8-1ml 穿孔緩沖液，上下顛倒10次；
6) 重復(fù)步驟4)、5) 兩次。
4. ChiTag轉(zhuǎn)座體結(jié)合抗體（1.5h）
1) 快速離心EP管，將管蓋液體離心下來，將EP管靜置于磁力架沉淀細胞，去溶液。
2) 將ChiTag轉(zhuǎn)座體1:250稀釋于穿孔緩沖液2中，并滴加于細胞上，輕柔震蕩；
3) 室溫下將EP管置于搖床上孵育1h；
4) 快速離心細胞，將管蓋液體離心下來，將EP管靜置于磁力架沉淀細胞，去溶液。
5) 管中加入0.8-1ml穿孔緩沖液2，上下顛倒10次；
6) 重復(fù)步驟4)、5) 兩次。
5. 激活ChiTag轉(zhuǎn)座體，片段化目的DNA（1h）
1) 快速離心EP管，將管蓋液體離心下來，將EP管靜置于磁力架沉淀細胞，去溶液。
2) 管中加入300μl ChiTag激活緩沖液，輕柔震蕩；
3) 37ºC孵育1h。
6. DNA提?。?h）
7. PCR（1h），PCR之前需加入72ºC，5min步驟
8. DNA純化（30min）
9. 上機測序
具體時間、轉(zhuǎn)速需要根據(jù)不同的樣本、不同的研究目的進行優(yōu)化。
 
 
 
四、CUT&Tag的局限性
1. CUT&Tag的自然狀態(tài)并不適合所有研究
未經(jīng)固定的細胞不適用CUT&Tag。在CUT&Tag最初的文章中，此技術(shù)只用于組蛋白修飾、NPAT、CTCF。許多轉(zhuǎn)錄因子并不大量表達，且與DNA結(jié)合是微弱的、瞬時的，甚至有時候是間接的與染色質(zhì)結(jié)合。對于這些情況，染色質(zhì)交聯(lián)和超聲處理是檢測蛋白質(zhì)-DNA相互作用的必要步驟。
大多數(shù)ChIP級別抗體，經(jīng)驗證可用于交聯(lián)條件下，然而無法在自然情況下具有好的作用，因為交聯(lián)條件下的蛋白質(zhì)表位可能不同于自然狀態(tài)下的蛋白質(zhì)表位。因此從X-ChIP轉(zhuǎn)到CUT&Tag需要進行抗體驗證，以確定抗體在不固定的條件下的特異性和敏感性。
2. CUT&Tag可能引入偏差
用于CUT&Tag的Tn5轉(zhuǎn)座酶對開放染色質(zhì)區(qū)域具有高度親和性。因此，CUT&Tag可能優(yōu)先適用于分析組蛋白修飾或與基因組活躍轉(zhuǎn)錄區(qū)域相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子，而不是非常適合于沉默或含有異染色質(zhì)的基因組區(qū)域。消化時間和pA-Tn5使用量需要每個目標(biāo)仔細優(yōu)化，以避免任何不特異的轉(zhuǎn)座反應(yīng)。
3. CUT&Tag技術(shù)還太新
雖然CUT&Tag已經(jīng)出現(xiàn)了有一段時間了，且很快就流行了起來。但是在2019年4月才首次發(fā)表詳細的實驗方案。因此，在同行評議中并沒有很多包含CUT&Tag結(jié)果的數(shù)據(jù)出現(xiàn)。另外，CUT&Tag實驗流程與ChIP-Seq相差很大，兩者的數(shù)據(jù)對比也比較困難，