脊柱“緩震器”磨損何解？中國繪首份椎間盤單細胞圖譜

       人類有23個椎間盤（IVD），其厚度約占骶椎以上脊柱全長的1/4。這些椎間盤被稱為是脊柱“緩震器”，但它們的磨損卻可能從20歲就開始，隨著年齡的增長，磨損日益嚴(yán)重，由此導(dǎo)致所謂的椎間盤退行性疾病 (DDD)。

       “椎間盤退行性疾病是與椎間盤退變相關(guān)的一大類疾病的統(tǒng)稱，包括大眾所熟知的頸椎病、腰椎間盤突出癥、腰椎管狹窄癥等。”近日，陸軍軍醫(yī)大學(xué)陸軍特色醫(yī)學(xué)中心（大坪醫(yī)院）骨科主任、外科學(xué)與野戰(zhàn)外科學(xué)教研室主任劉鵬教授在接受澎湃新聞（www.thepaper.cn）記者采訪時表示，“在年齡增長、反復(fù)及多次應(yīng)力作用等綜合因素影響下，椎間盤三個組成部分會不同程度的發(fā)生老化，專業(yè)描述稱之為‘退行性變’。”值得注意的是，這類退行性疾病目前在醫(yī)學(xué)上尚未有“治本”的手段，劉鵬團隊聯(lián)合解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學(xué)中心劉兵研究員團隊，近年來“從零”開始探索。日前，Bone Research雜志以封面形式在線發(fā)表了劉鵬等人的一項研究，題為“Spatially defined single-cell transcriptional profiling characterizes diverse chondrocyte subtypes and nucleus pulposus progenitors in human intervertebral discs（空間解析單細胞轉(zhuǎn)錄譜表征人類椎間盤不同的軟骨細胞亞型和髓核祖細胞）”。

       “我們的研究策略是從健康椎間盤獲得了十萬個細胞，逐個進行測序，再整合起來進行生物信息學(xué)分析，這種技術(shù)叫做單細胞轉(zhuǎn)錄組測序。最終，我們在世界上首次系統(tǒng)繪制了含有空間信息的人類椎間盤單細胞圖譜，更新了人類對椎間盤細胞組成的認知。”

       劉鵬認為，更重要的是，這項研究從轉(zhuǎn)錄組和功能學(xué)層面鑒定得到一群新型的髓核祖細胞（NPPC），“這種細胞被證明具有干細胞的特征，具有再生的潛能，為建立椎間盤退行性疾病的生物治療策略提供了重要線索。”

       劉鵬和劉兵為該研究的共同通訊作者，陸軍軍醫(yī)大學(xué)陸軍特色醫(yī)學(xué)中心（大坪醫(yī)院）骨科甘翼搏博士后與軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院蛋白質(zhì)組學(xué)國家重點實驗室賀健博士為共同第一作者，陸軍特色醫(yī)學(xué)中心為第一完成單位。該研究工作得到了陸軍特色醫(yī)學(xué)中心軍事醫(yī)學(xué)培養(yǎng)計劃、國家自然科學(xué)基金委、重慶市博新計劃、創(chuàng)傷燒傷與復(fù)合傷國家重點實驗室多個基金項目的資助。

       “治標(biāo)”第一步：繪制人類椎間盤單細胞圖譜

       在過去的研究中，科學(xué)家不斷探索椎間盤生理學(xué)和病理學(xué)機制，尋求重建椎間盤穩(wěn)態(tài)的創(chuàng)新治療方法。然而，椎間盤細胞的異質(zhì)性以及分子特征的復(fù)雜性為退變生理病理機制的探索帶來了重大挑戰(zhàn)。

       “椎間盤是連接椎體最關(guān)鍵的結(jié)構(gòu)，它由軟骨終板、纖維環(huán)和髓核三部分組成，其生理作用是維持椎體之間的連接、運動并吸收震蕩，可以將之視為脊柱的‘緩震器’。”劉鵬提到，雖然椎間盤退行性疾病是人體衰老的一部分，但是對健康造成的影響是巨大的，最常見的就是頸肩痛和腰腿痛。

       現(xiàn)有的治療方法主要分為保守治療與手術(shù)治療。保守治療手段包括休息、藥物和物理治療等；而手術(shù)治療以髓核摘除、神經(jīng)組織減壓為主要手段，可根據(jù)情況決定是否同時實施脊柱融合術(shù)。

       “總體而言，目前治療方法的臨床效果是滿意的，但是深入分析其治療原理可知，目前療法均以緩解癥狀為主要目的，也就是老百姓俗稱的‘治標(biāo)’，并沒有做到真正減緩、阻止或者逆轉(zhuǎn)‘椎間盤退變’這一核心病理改變。”劉鵬表示，多年來，學(xué)者們共同希望能夠探索新的生物學(xué)治療方法，以期徹底根治椎間盤退行性疾病，力爭做到“治本”。

       實際上，既往的研究發(fā)現(xiàn)，人類椎間盤內(nèi)有很多不同類型的細胞成分。而人類椎間盤的細胞多樣性也與多種未知功能有關(guān)。例如，椎間盤干細胞可能在椎間盤發(fā)育、損傷和修復(fù)過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。但到，由于技術(shù)手段受限，迄今為止仍難以精確解析人類椎間盤內(nèi)各細胞亞群的分子特征，起源及其調(diào)控機制。人類椎間盤的單細胞轉(zhuǎn)錄組全景圖。

       在劉鵬等人的這項最新研究中，研究人員從13-31周歲的研究人群中獲得健康椎間盤（Pfirrmann I級），從中分離髓核、纖維環(huán)和終板組織，最終對108108個椎間盤髓核、纖維環(huán)及終板組織的細胞進行了單細胞轉(zhuǎn)錄組測序和分析。

       研究團隊通過整合分析鑒定得到以下主要細胞亞群：3群軟骨細胞亞群、脊索細胞、基質(zhì)細胞、周細胞、內(nèi)皮細胞、髓核祖細胞，血細胞，成骨細胞以及少量的神經(jīng)細胞。

       隨后，研究人員還根據(jù)細胞外基質(zhì)（ECM）穩(wěn)態(tài)的特征差異，將3群軟骨細胞進行了重新分類，進一步鑒定為調(diào)控型、穩(wěn)態(tài)型和效應(yīng)型。研究認為，調(diào)控型軟骨細胞主要在細胞因子表達和軟骨生成相關(guān)調(diào)控通路中發(fā)揮調(diào)控作用；穩(wěn)態(tài)型軟骨細胞亞群相對靜息并且分化完全，與基質(zhì)合成和節(jié)律調(diào)節(jié)相關(guān)；效應(yīng)型軟骨型細胞具有較高代謝活性特征。

      研究認為，這些軟骨細胞亞群在胞外基質(zhì)特征的差異，為進一步探索軟骨細胞維持椎間盤穩(wěn)態(tài)的機制提供了一個新的視角。髓核祖細胞（NPPC）的特征和功能鑒定。

      研究還發(fā)現(xiàn)，髓核祖細胞亞群特異性高表達間充質(zhì)祖細胞標(biāo)記物PDGFRA和中胚層來源間充質(zhì)標(biāo)志物PRRX1，提示髓核內(nèi)可能存在具有干性潛能的細胞群體。進一步分析發(fā)現(xiàn)部分髓核祖細胞亞群高表達干性基因PROCR，和軟骨生成相關(guān)的重要轉(zhuǎn)錄因子SMAD3，同時運應(yīng)免疫熒光染色證實了PROCR+細胞內(nèi)p-SMAD3高度活化。

       隨后，研究人員利用PROCR富集分選了髓核祖細胞群體，并發(fā)現(xiàn)該細胞群具有較強的體外克隆形成能力。最后，與擬時序分析一致，體外實驗證實PROCR+細胞具有成骨、成軟骨和成脂三系分化能力。

       劉鵬表示，“我們這項研究的初心，旨在以人體的最基本結(jié)構(gòu)，也就是細胞為尺度，來研究椎間盤的細胞構(gòu)成和細胞微環(huán)境。”

       他總結(jié)道，總的來說，他們這項研究發(fā)現(xiàn)椎間盤內(nèi)部有多種功能各異的軟骨細胞，根據(jù)其功能進行了全新分類；更重要的是，發(fā)現(xiàn)了一種新型的髓核祖細胞，這種細胞被證明具有干細胞的特征，具有再生的潛能。“我們的研究是國際上首次在單細胞水平上對人類椎間盤的系統(tǒng)研究，對于人類認識椎間盤、治療椎間盤退行性疾病有重要的意義。”研究模式圖。

       逆轉(zhuǎn)退變，再生一個椎間盤？

       值得注意的是，目前椎間盤研究領(lǐng)域主要聚焦有兩個大方向：一是椎間盤退變病理機制研究，二是治療策略研究。

       劉鵬等人的研究并不屬于這兩個熱門方向，但其認為，“卻對這兩個熱門方向都有重要的啟示意義。”他認為，研究椎間盤在生理狀態(tài)下的細胞成分和細胞微環(huán)境構(gòu)成，是從最底層來解析椎間盤的基本構(gòu)成與功能。這一單細胞圖譜或?qū)槔斫庾甸g盤病理改變、治療椎間盤退行性疾病提供了重要的線索寶庫。

       就劉鵬課題組而言，他們一直夢想著用類器官構(gòu)建的方法來嘗試解決退行性椎間盤疾病。一般來說，人類在從20-25歲開始，脊柱就開始退化。當(dāng)然，我們通常不會看到年輕人頻繁背痛，椎間盤需要較長的磨損時間。此外，正常衰老也不是椎間盤退變的唯一原因，其他原因也會導(dǎo)致。

       “眾所周知，利用組織工程技術(shù)，已經(jīng)可以制造一個人工的、鮮活的鼻子或者耳朵，用于器官缺損修復(fù)與整形手術(shù)。我們則希望用類似的方法來替換已經(jīng)發(fā)生病變的椎間盤，或者使用生物學(xué)技術(shù)來逆轉(zhuǎn)椎間盤退變。”劉鵬將之稱為“椎間盤再生醫(yī)學(xué)”。

       然而，長期存在的爭論的是，什么樣的細胞可以再生一個椎間盤出來？“我們一直相信最有潛力的細胞就在椎間盤內(nèi)部。”

       劉鵬強調(diào)，這項研究也初步驗證了他們的猜想，“發(fā)現(xiàn)了一群稀有細胞，它有一些干細胞的標(biāo)志基因，我們將之稱為髓核祖細胞。髓核組細胞不但有良好的成克隆能力，還能分化成為骨、軟骨細胞。進一步應(yīng)用生物信息學(xué)技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)，血小板生長因子和轉(zhuǎn)化生長因子具有促進髓核祖細胞增殖和軟骨形成的作用。”

       劉鵬認為，所有這些結(jié)果提示，合理地運用細胞因子，有望用髓核祖細胞來實現(xiàn)椎間盤髓核的再生修復(fù)。

       在前期的這些研究中，劉鵬等人建立了健康椎間盤的單細胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫，但是這些信息仍然僅是冰山一角。“我們現(xiàn)在把這個數(shù)據(jù)庫共享給全世界同行，希望與同行共同努力，深入理解椎間盤的細胞構(gòu)成、功能與細胞間相互作用，深入探索椎間盤退行性疾病的生物學(xué)治療策略與手段。”

       他們最終希望，能在現(xiàn)有“治標(biāo)”的基礎(chǔ)上做到“治本”。

       論文鏈接：https://www.nature.com/articles/s41413-021-00163-z

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