腫瘤駐留的細(xì)胞內(nèi)微生物群促進(jìn)乳腺癌轉(zhuǎn)移定植

宿主微生物群，作為不可忽視的身體成分，是調(diào)節(jié)癌癥易感性和腫瘤進(jìn)展的重要媒介，除了眾所周知的遺傳、表觀遺傳和基質(zhì)微環(huán)境因素。這些微生物主要通過(guò)間接途徑(包括代謝物和免疫系統(tǒng))對(duì)遠(yuǎn)端或近端腫瘤組織發(fā)揮作用，特別是在與腸道微生物群密切接觸的結(jié)直腸癌中。然而，近年來(lái)，有新的證據(jù)表明，微生物也是腫瘤組織本身的組成部分，在更廣泛的癌癥類型中，除了結(jié)直腸癌，如胰腺癌、肺癌、乳腺癌等，最初認(rèn)為這些癌癥是無(wú)菌的。臨床研究表明，組織駐留的微生物群特征與癌癥風(fēng)險(xiǎn)、病理類型、癌癥預(yù)后和治療反應(yīng)。使用患者來(lái)源的異種移植(PDX)模型的研究表明，在免疫缺陷小鼠中，腫瘤內(nèi)微生物群可以隨著腫瘤進(jìn)展而持續(xù)存在。通過(guò)尾靜脈給藥外源性細(xì)菌會(huì)損害腫瘤的化療敏感性并促進(jìn)腫瘤進(jìn)展。
盡管越來(lái)越多的證據(jù)表明腫瘤內(nèi)微生物群的重要性，但低生物量腫瘤微生物群在其生理穩(wěn)態(tài)狀態(tài)下是否在腫瘤自發(fā)發(fā)展中發(fā)揮重要的生物學(xué)作用仍是一個(gè)懸而未決的問(wèn)題。一個(gè)能夠再現(xiàn)人類腫瘤微生物群的動(dòng)物自發(fā)腫瘤模型將極大地推動(dòng)腫瘤常駐微生物群的功能研究，并闡明其在腫瘤進(jìn)展中的意義。
近日，發(fā)表在《Cell》上的一篇研究通過(guò)使用小鼠自發(fā)乳腺腫瘤模型MMTV-PyMT來(lái)探討這些腫瘤內(nèi)細(xì)菌的功能意義。研究發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)，在不影響原發(fā)腫瘤生長(zhǎng)的情況下，去除腫瘤內(nèi)細(xì)菌可以顯著減少肺轉(zhuǎn)移。在轉(zhuǎn)移定植過(guò)程中，循環(huán)腫瘤細(xì)胞攜帶的腫瘤內(nèi)細(xì)菌通過(guò)重組肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架增強(qiáng)了宿主細(xì)胞對(duì)流體剪切應(yīng)力的抵抗力，從而促進(jìn)了宿主細(xì)胞的生存。研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，在兩種具有顯著不同轉(zhuǎn)移潛能水平的小鼠腫瘤模型中，腫瘤內(nèi)注射從腫瘤駐留菌群中分離出來(lái)的選定細(xì)菌菌株可促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移。研究結(jié)果表明，腫瘤駐留菌群雖然生物量較低，但在促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移方面發(fā)揮了重要作用，因此，對(duì)其干預(yù)可能值得探索，以促進(jìn)腫瘤護(hù)理。
 
自發(fā)小鼠BT含有大量的活細(xì)菌
研究人員通過(guò)16S測(cè)序全面描述組織駐留菌群的組成。對(duì)16S文庫(kù)構(gòu)建流程進(jìn)行了優(yōu)化，通過(guò)添加生物素富集步驟來(lái)減少非特異性基因組序列，比傳統(tǒng)方法檢測(cè)腸道菌群的靈敏度顯著提高。據(jù)此，研究分析了正常組織和腫瘤組織中的微生物群(圖1)。無(wú)監(jiān)督聚類分析顯示，對(duì)照(NTC和EBC)、正常乳腺組織和BT組織具有明顯的微生物群落(圖1I)。陰性對(duì)照樣品中大部分微生物為變形菌門(Proteobacteria，圖1G和S1I)，而組織樣品富集為厚壁菌門(Firmicutes，圖1G)。研究數(shù)據(jù)共同表明PyMT自發(fā)性腫瘤中含有大量的活菌。

圖1所示。微生物群是MMTV-PyMT自發(fā)乳腺腫瘤的重要組成部分
 
 
圖S1。在門和屬水平上優(yōu)化EBC對(duì)照組、正常乳腺和乳腺腫瘤組織常駐菌群分析及菌群相對(duì)豐度，與圖1和STAR方法相關(guān)
 
清除腫瘤內(nèi)的微生物會(huì)阻礙腫瘤的轉(zhuǎn)移，但不會(huì)阻礙原發(fā)腫瘤的生長(zhǎng)
通過(guò)測(cè)試不同的抗生素組合和給藥途徑來(lái)選擇性地消除腫瘤駐留或腸道微生物群(圖3A)。研究發(fā)現(xiàn)使用雞尾酒抗生素(ATBx)，通過(guò)飲用水(DW)可以有效清除腸道和腫瘤微生物菌群。當(dāng)ATBx經(jīng)尾靜脈靜脈注射時(shí)，腫瘤菌群被清除，而腸道菌群保持完整(圖3B和3C)。通過(guò)DW給藥穿透細(xì)胞膜的抗生素多西環(huán)素具有與ATBx-IV相似的效果(圖3B和3C)。最重要的是，ATBx-IV和Dox-DW處理在腸道活菌數(shù)量、腸道微生物群譜和腫瘤免疫譜方面與對(duì)照組保持相當(dāng)(圖S3A S3D和S3F S3I)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)ATBx-DW能有效地減緩自發(fā)MMTV-PyMT BTs的腫瘤生長(zhǎng)(總腫瘤重量為15±對(duì)照組為0.5g，而ATBx-DW為11±0.8g)，而單獨(dú)用ATBx-IV或Dox-DW消除腫瘤微生物群并不影響腫瘤總重量(圖3D)。這表明腸道菌群在腫瘤生長(zhǎng)中起著重要作用，而腫瘤菌群則不然。

圖3。腫瘤駐留菌群是PyMT腫瘤自發(fā)轉(zhuǎn)移的必要條件
 
圖S3?？股貙?duì)PyMT腫瘤的治療效果與腸道微生物群有關(guān)
 
在MMTV-PyMT腫瘤發(fā)展的晚期，大多數(shù)荷瘤小鼠發(fā)生肺轉(zhuǎn)移。研究者發(fā)現(xiàn)原發(fā)腫瘤中微生物群的存在與肺轉(zhuǎn)移的存在相關(guān)性較弱;細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌數(shù)量與細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌數(shù)量呈較強(qiáng)的線性相關(guān) (圖3 e)。這提示細(xì)胞內(nèi)的微生物群可能參與了腫瘤的轉(zhuǎn)移。由于ATBx-DW既消除了腸道菌群，也消除了腫瘤菌群，因此ATBx-DW在降低腫瘤總重量的同時(shí)也表現(xiàn)出抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的作用(圖3F)。這些數(shù)據(jù)共同表明，腫瘤內(nèi)細(xì)菌在PyMT BT轉(zhuǎn)移中是必不可少的。
 
為了可視化腫瘤轉(zhuǎn)移過(guò)程中微生物群的動(dòng)態(tài)變化，研究人員繪制了不同樣本中不同細(xì)菌屬的豐度，以NB、BT、MAL、LM的順序作為腫瘤進(jìn)展的指示。有趣的是，無(wú)監(jiān)督聚類將細(xì)菌分為具有不同動(dòng)態(tài)模式的四類(圖4H和4I)。顯性聚類增加了乳腺組織中的豐度，微轉(zhuǎn)移持續(xù)，大轉(zhuǎn)移減少(圖4H和4I)。
為了進(jìn)一步驗(yàn)證細(xì)菌可以與腫瘤細(xì)胞一起在循環(huán)系統(tǒng)中傳播的假設(shè)，研究人員將紅霉素耐藥元件- gfp (erm-GFP)植入木糖鏈球菌基因組中，以在空間和時(shí)間上追蹤細(xì)菌(圖4J)。結(jié)果表明，細(xì)菌可以，但只能與腫瘤細(xì)胞一起，通過(guò)循環(huán)系統(tǒng)，并在遠(yuǎn)端器官定植。

圖 4.PyMT腫瘤細(xì)胞在轉(zhuǎn)移過(guò)程中攜帶微生物群
 
某些細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌促進(jìn)轉(zhuǎn)移定植
為了探究單個(gè)菌株的侵襲是否對(duì)腫瘤細(xì)胞在轉(zhuǎn)移過(guò)程中的定植有任何作用，研究者通過(guò)尾靜脈將四種菌株侵襲的腫瘤類器官注射回小鼠體內(nèi)，并利用組織清查成像技術(shù)對(duì)轉(zhuǎn)移定植情況進(jìn)行分析。體外和體內(nèi)功能測(cè)試表明，在不同的腫瘤遺傳小鼠模型中，細(xì)菌的入侵可以功能性地促進(jìn)BT的轉(zhuǎn)移。
 
研究對(duì)從類器官培養(yǎng)中分離的細(xì)菌入侵癌細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞RNAseq分析(圖6A)。 KEGG通路分析顯示，被細(xì)菌入侵的腫瘤細(xì)胞開(kāi)啟了許多免疫相關(guān)信號(hào)，包括toll樣受體信號(hào)通路、nod樣受體信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、NF-κB信號(hào)通路、Th17信號(hào)通路、細(xì)胞因子趨化因子相關(guān)通路等(圖6C)。有趣的是，研究發(fā)現(xiàn)木糖擬南芥、動(dòng)物擬南芥、兔丘擬南芥和馬血擬南芥對(duì)腫瘤細(xì)胞的侵襲特異性地觸發(fā)了流體剪切應(yīng)力途徑。
 
通過(guò)建立了一個(gè)循環(huán)系統(tǒng)與蠕動(dòng)泵來(lái)模擬流體剪切應(yīng)力的血管(圖6 d)。這種表型表明細(xì)菌可能在肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的組織中發(fā)揮作用。。
為了測(cè)試細(xì)菌誘導(dǎo)的收縮力的緩解是否有利于循環(huán)腫瘤細(xì)胞在體內(nèi)血流剪切力下的存活，研究者通過(guò)尾靜脈將細(xì)菌相關(guān)的癌細(xì)胞靜脈注射回免疫缺陷的NPSG小鼠，以避免免疫系統(tǒng)的間接影響(圖6)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)木糖擬南芥、動(dòng)物擬南芥和小囊擬南芥能顯著提高肺癌細(xì)胞的存活率，分別為6.4倍、5.0倍和3.4倍(圖6N和6O)。

圖 6.細(xì)胞內(nèi)微生物群重組細(xì)胞骨架并促進(jìn)對(duì)機(jī)械應(yīng)力的抵抗力
 
人類BT保守菌群圖譜
在人類乳腺癌中，原發(fā)腫瘤和轉(zhuǎn)移部位之間的微生物群聯(lián)系尚不清楚。通過(guò)采集伴有配對(duì)腫瘤相鄰正常乳腺組織和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的人BT組織，通過(guò)16S測(cè)序分析其微生物菌群組成。這些數(shù)據(jù)表明，小鼠BT和人類BT具有相似的微生物群落結(jié)構(gòu)和動(dòng)態(tài)，表明人類BT的微生物群可能在人類癌癥的發(fā)病和發(fā)展中發(fā)揮保守的作用。

圖7。人乳腺癌原發(fā)部位與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有相關(guān)性